透明质酸及其合成酶在炎症牙髓组织中的表达

透明质酸(hyaluronic acid, HA)作为糖胺聚糖家族成员，是细胞外基质的主要成分。它是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺的双糖单位重复数千次组成的大分子酸性粘多糖，分子量可达到5×106ku。透明质酸由细胞膜上一组高度专一性的透明质酸合成酶(hyaluronic acid synthase, HAS)合成，并分泌到细胞外基质中。HAS有3种保守的同工酶，在哺乳动物中，分别为HAS1、HAS2、HAS3。HAS1和HAS2能够合成高分子量透明质酸(2 000 ku)，而HAS3合成低分子量透明质酸(100～1 000 ku)[1]。透明质酸具有许多不同的生物学功能，能够维持组织结构稳定、重塑组织、调节细胞形态变化、调节细胞信号传导，细胞粘附及细胞的增殖分化等。研究证明透明质酸在多种生理和病理过程中作为一种重要的调节剂，特别在炎症反应中具有重要的作用[2-3]。近年来，透明质酸在口腔疾病治疗中的应用日益受到关注，特别是其在颞下颌关节炎[4]、牙周炎[5]、种植体周围炎[6]等感染性炎症疾病的治疗中取得了较好的疗效[7]。透明质酸还可以作为支架材料应用于组织工程以实现组织的再生[8-9]。Ferroni等运用外源性透明质酸支架复合人牙髓干细胞，在体外成功获得牙髓样组织[10]。然而机体内源性透明质酸及其合成酶与牙髓组织炎症状态的相关研究至今鲜有报道。因此，本研究旨在通过系统检测炎症牙髓组织中内源性透明质酸及其合成酶的表达，为研究其在牙髓组织炎症调控过程中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本的收集

本研究经同济大学附属口腔医院伦理委员会批准，事先向患者告知，知情同意后进行。临床收集患者因埋伏阻生而预防性拔除的健康下颌第三磨牙(n>5)，以及萌出后因龋坏导致牙髓炎而拔除的下颌第三磨牙(n>5)。

1.2 组织学处理及苏木素-伊红(HE)染色

在无菌操作台内，使用高速涡轮机纵向磨开正常及炎症状态的第三磨牙，不伤及牙髓组织情况下取出正常及炎症状态的牙髓组织。PBS冲洗后用4%多聚甲醛(PFA)固定在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中，室温固定20 h，石蜡包埋。制作5 μm厚的组织学切片，60 ℃烤片过夜，4 ℃下保存备用。切片用于后续HE染色，免疫组织化学染色以及免疫荧光共染。将预备好的切片经脱蜡、二甲苯和乙醇梯度复水，常规HE染色、光镜观察组织学变化，确定牙髓组织正常及炎症状态。

1.3 免疫组织化学染色及免疫荧光染色实验

本次实验所有购买的抗体都有在线验证数据，具体信息如下。一抗：兔多克隆抗-TNFα(1∶100, Immunoway, YT-4689, 美国)；羊多克隆抗-HA(1∶100, Abcam, ab-, 美国)；山羊多克隆抗-HAS1(1∶100, Santa Cruz, sc-, 美国)；兔多克隆抗-HAS2(1∶100, 博士德, ba3397, 中国)和山羊多克隆抗-HAS3(1∶100, Santa Cruz, sc-, 美国)。二抗：Alexa Fluor?488-驴抗兔IgG(1∶200, Life technology, 美国)；Alexa Fluor?546-驴抗山羊IgG(1∶200, Life technology, 美国)和donkey anti-goat IgG(1∶1 000, Abcam, ab-6884, 美国)。

免疫组化染色使用免疫组化试剂盒(迈新, KIT9707-兔, 中国)。组织切片常规脱蜡至水；PBS清洗后置于3% H2O2中10 min，灭活内源性过氧化物；37 ℃酶消化法孵育1 h进行抗原修复，PBS漂洗后5% BSA孵育30 min，再在4 ℃和一抗孵育过夜。阴性对照组的组织切片用PBS代替一抗孵育。PBS漂洗后二抗室温孵育20 min，再次PBS漂洗后与链霉亲和素标记的过氧化物酶室温反应20 min，以3,3′-二氨基联苯胺(DAB)为显色剂，苏木素复染，封片剂(YEASEN, ES08, 上海)封片，立体显微镜(Carl Zeiss, Stemi508,德国)及数码显微镜(Nikon Eclipse 80i, 日本)观察。

免疫荧光检测先将组织切片与荧光二抗在室温下孵育1 h。使用DAPI(Sigma, D9542-10MG, 美国)进行细胞核染色，使用甘油封片，镜检拍照，荧光显微镜观察((尼康 DS-Ri1-U3, 日本)；(尼康Intersilight C-HGF1, 日本))。

1.4 实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)

用Trizol试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, 美国)裂解牙髓组织，分离总RNA。提取的RNA用互补DNA合成试剂盒(Roche, Schlieren, 瑞士)进行逆转录，用FastStart Essential DNA Green Master(Roche, Schlieren, 瑞士)进行反应，qRT-PCR法反应检测IL-6、IL-8、TNFα、HAS1、HAS2 及 HAS3的mRNA的表达。采用分析软件分析PCR过程，每个样本设置3个复孔，以CT值代表荧光qRT-PCR的结果，ΔCT = CT目的基因-CT内参基因，ΔΔCT = ΔCT实验组-ΔCT对照组。根据公式2-ΔΔCT计算出实验组中目的基因的相对表达量，根据溶解曲线判断扩增产物的特异性。使用SPSS 20.0单因素ANOVA进行统计学分析，Graphpad 7.0进行绘图。引物序列见表1。

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